Soluciones biotecnológicas para el control y diagnóstico molecular de Neofabraea spp

Soluciones biotecnológicas para el control y diagnóstico de Neofabraea spp, agente causal de la “pudrición del ojo de buey” en manzanas 

Beatriz Riverón, Bioquímico farmacéutica

  Las manzanas son una de las frutas más consumidas a nivel mundial y tienen una importancia inmensa en la industria agrícola. Según datos de la FAO, la especie de manzana domesticada, Malus domestica (familia Rosaceae) se ubica como la tercera fruta más producida en el mundo, después de los plátanos y las sandías. Las manzanas se caracterizan por sus abundantes compuestos bioactivos, que incluyen vitaminas, ácidos orgánicos, compuestos fenólicos y antioxidantes. También, son la base de una importante industria de procesamiento de alimentos que incluye la producción de jugo concentrado, jugo natural, sidra y otras conservas. Además, la utilización de residuos de manzana como fuente valiosa de celulosa y fibra dietética también es muy considerada. Sin embargo, a pesar de su importancia, la producción de manzanas enfrenta varios desafíos. En particular, la prevalencia de la “pudrición del ojo de buey” y otras enfermedades de almacenamiento. Estas representan una amenaza para la calidad y la seguridad de la fruta. Dadas las demandas del mercado y la utilización generalizada de manzanas, garantizar una calidad constante del producto y condiciones de almacenamiento óptimas se han vuelto primordiales. Esto no solo facilita el procesamiento posterior, sino que también minimiza las pérdidas para los productores.  

"Ojo de buey", una enfermedad latente

Neofabraea sp. es el nombre actual del hongo patógeno que causa la “pudrición del ojo de buey” en las manzanas. Esta enfermedad tiene un carácter latente. Sus síntomas aparecen durante el almacenamiento de manzanas en cámaras frigoríficas, mientras que la infección real ocurre unos meses antes, en los huertos, durante la temporada de crecimiento. Las esporas de hongos son la fuente de estas infecciones. Estas se transfieren a los frutos junto con las gotas de lluvia a través de espiráculos o picaduras de insectos (patógenos de heridas). La enfermedad se manifiesta en las manzanas en forma de pequeñas manchas marrones, que crecen y se vuelven permanentes. La pulpa dentro de la mancha colapsa. Bajo la piel, se forman pequeños cuerpos fructíferos del hongo, llamados acérvulos, con conidios de color marrón amarillento. Posteriormente, la fruta infectada se cubre con una capa de micelio blanco grisáceo. La baja temperatura de los almacenes y cámaras frigoríficas favorece el desarrollo de enfermedades en los frutos almacenados. Como han informado los agricultores, las pérdidas de rendimiento provocadas por la aparición de estos patógenos pueden llegar hasta un 50 % en condiciones desfavorables.  

Diagnóstico y biocontrol

El diagnóstico molecular y el biocontrol, pueden desempeñar un papel crucial en cultivos de manzanos. Estas técnicas posiblemente puedan ayudar en la detección temprana y el manejo oportuno de la enfermedad, reduciendo así las pérdidas económicas para los productores. Especialmente la probiotecnología, que es el uso de microorganismos benéficos, es un campo en desarrollo que tiene el potencial de ofrecer muchas ventajas. Estas incluyen las prácticas agrícolas más sostenibles y una mejor seguridad alimentaria. El diagnóstico molecular, incluye métodos biotecnológicos que implican tomar la información genética única del patógeno y analizar las secuencias de ADN en busca de señales de alerta que puedan indicar la aparición potencial de una enfermedad específica.   [caption id="attachment_25055" align="aligncenter" width="534"] Ciclo de desarrollo de Neofabraea spp, métodos de detección y métodos de biocontrol, de Oszust et al. (2023)[/caption] En la figura se representa un esquema general del ciclo de desarrollo de Neofabraea spp. y métodos biotecnológicos tales como biopreparados de biocontrol y métodos de detección molecular potencialmente utilizados para contrarrestar sus efectos adversos en la producción de manzanas, Los fungicidas que se utilizan actualmente en la producción de manzanas, tienen una amplia gama de actividad. Son eficaces y contrarrestan exitosamente el desarrollo de patógenos fúngicos, incluidos representantes del género Neofabraea. Sin embargo, estas sustancias químicas contribuyen a una reducción de la biodiversidad de hongos beneficiosos. Además, generan preocupaciones en la sociedad sobre la seguridad y la salud de los productos agrícolas. Se están buscando formas alternativas de controlar estas plagas como tratamientos físicos, con agua caliente o aire caliente, ozonización, radiofrecuencias y microondas, presiones hipobáricas e hiperbáricas y radiación ultravioleta lejana (luz UV-C). También, el tratamiento con compuestos naturales (compuestos orgánicos volátiles) y antagonistas microbianos. Sin embargo, la mayoría de los tratamientos alternativos en forma aislada, tiene limitaciones. La perspectiva de utilizar varios agentes biológicos en la horticultura incluye una mayor participación de una variedad de agentes de protección. Por otro lado, puede constituir un complemento valioso para el programa de protección de plantas. Su innegable ventaja es la ausencia de residuos en la fruta y su seguridad para la salud humana y el medio ambiente, que actualmente es objeto de gran atención. Ampliar la variedad de estos agentes (biológicos) alternativos es especialmente importante no solo para el cultivo de plantas orgánicas sino también para apoyar la producción integrada. El uso de microorganismos en la horticultura garantizaría la seguridad alimentaria y limitaría los cambios ambientales y climáticos adversos.  

Potenciales agentes de biocontrol de Neofabraea

Microorganismos

Un grupo de investigadores presentó recientemente, levaduras endófitas, específicamente Vishniacozyma victoriae, como posibles agentes de biocontrol contra Neofabraea en manzanas. La actividad de biocontrol observada se atribuyó a la capacidad de estas levaduras para formar biopelículas y producir compuestos orgánicos volátiles. Metschnikowia pulcherrima es otra levadura que también se ha investigado por su potencial de biocontrol contra la pudrición del ojo de buey de la manzana. Su actividad antagónica probablemente se deba a la producción de compuestos antifúngicos como la pulcherrimina y toxinas. También puede superar al patógeno por los nutrientes y el espacio en la superficie de la fruta, lo que reduce la incidencia de enfermedades. Cryptococcus flavescens, una levadura anamórfica (puede presentarse en la forma unicelular o micelial) que se encuentra comúnmente en el medio ambiente. Ttambién ha mostrado potencial de control biológico contra varios patógenos fúngicos, incluidas las especies de Neofabraea. Su mecanismo de acción implica principalmente la producción de metabolitos antifúngicos, incluidas micocinas y compuestos orgánicos volátiles, que inhiben el crecimiento de patógenos. Además, puede competir con el patógeno por los recursos nutritivos y el espacio en la superficie de la fruta. Esto reduce su desarrollo y de la enfermedad. También, ciertas cepas de bacterias pertenecientes a las especies Pseudomonas fluorescens y Pantoea agglomerans han mostrado actividad antagónica frente a Neofabraea. Producen metabolitos antifúngicos y enzimas que suprimen el crecimiento del patógeno. Bacillus subtilis ha demostrado un alto nivel de potencial de biocontrol contra Neofabraea en investigaciones de laboratorio. Un estudio realizado que se enfocó en el potencial de los hongos filamentosos, específicamente aislados de Trichoderma, demostró controlar efectivamente Neofabraea. La actividad de biocontrol de Trichoderma se atribuye a múltiples mecanismos, como la producción de compuestos inhibidores (incluidos los volátiles), micoparasitismo, inactivación de enzimas patógenas, inducción de resistencia sistémica de la planta y superación de patógenos por nutrientes y espacio vital a través de una vigorosa proliferación celular. En general, la exploración de estos diversos grupos de agentes de control biológico es muy prometedora para desarrollar estrategias efectivas contra Neofabraea spp., contribuyendo a mejorar el manejo de la pudrición del ojo de buey de la manzana y las prácticas agrícolas sostenibles.

Biopreparados

Los biopreparados basados en microorganismos incluyen hongos filamentosos, levaduras en combinación con células bacterianas. El mecanismo de acción de este tipo de biopreparados se basa en la formación de una biopelícula por parte de las bacterias, que incluye a todos los microorganismos antagónicos, y esto incide positivamente en su capacidad para desarrollarse en diferentes ambientes. El uso de estos productos proecológicos tiene un efecto positivo añadido sobre el crecimiento de las plantas y su resistencia a los fitopatógenos. Los ingredientes de los biopreparados son cepas cuidadosamente seleccionadas que no solo se eligen por sus propiedades antagónicas con respecto al patógeno objetivo, sino que también se formulan para incluir muchas características críticas como resistencia a los estreses bióticos y abiótico), la capacidad de producir biomasa en un medio microbiológico económico y relativamente simple, la tolerancia a la temperatura, la sequía, la salinidad, la radiación UV y la sensibilidad química.  

Identificación de Neofabraea

La presencia de patógenos se reconoce sobre todo cuando aparecen síntomas en la planta, sin embargo, la identificación precisa de Neofabraea spp. también es posible con el uso de un método de cultivo que identifique las características morfológicas del cultivo, como la tasa y el tipo de crecimiento y las observaciones macroscópicas que incluyen el color del cultivo junto con otras características morfológicas, como las dimensiones de los conidios o la longitud de las hifas. La mayoría de estas características es cuantitativa y la identificación debe realizarse en cultivo puro. Como resultado, los métodos clásicos por sí solos no son suficientes para el diagnóstico fitosanitario que requiere rapidez y confiabilidad. Otro enfoque utiliza el método de cultivo asociado con un análisis del material de ADN del patógeno (con el uso de marcadores genéticos). Este tipo de protocolo de diagnóstico recomienda el aislamiento de un cultivo puro del patógeno de las plantas hospedantes, seguido de pruebas de PCR específicas de especie. Cuando hay micelio presente en el material de prueba, también es posible realizar una prueba directa basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La literatura describe muchos protocolos de diagnóstico basados en el análisis del ADN del patógeno en una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), así como la utilización de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) para el diagnóstico y especies, diferenciación de muchos hongos fitopatógenos, incluyendo Neofabraea spp. Los marcadores genéticos universales para la identificación de hongos son estándar y también de uso común para otros hongos conservados, como fragmentos ITS1 o ITS2 o D2 LSU, pero también para genes funcionales como el que codifica la β-tubulina o el gen que codifica el citocromo b (cytb). Para evitar resultados falsos positivos o negativos, existe una tendencia creciente de utilizar paneles de detección que abarcan múltiples marcadores genéticos para identificar fitopatógenos fúngicos, y este enfoque se ha empleado recientemente para la detección de Neofabraea spp. también. En muchos casos, la capacidad de infectar plantas depende de la presencia y expresión de genes específicos, que distinguen a los hongos virulentos de los no virulentos estrechamente relacionados. Este fenómeno natural puede ser una característica de la especie, pero las diferencias también pueden aplicarse a cepas individuales. Estos genes codifican factores de virulencia, incluidas las proteínas y enzimas implicadas en la síntesis de factores responsables de la aparición de la infección. La identificación de genes en Neofabraea spp. necesario para la infección y por lo tanto para la inducción de la enfermedad en la manzana, es la base para identificar los mecanismos de infección y desarrollo de la enfermedad y por lo tanto para el desarrollo de estrategias del control. Las tecnologías mejoradas para la identificación de genes y el análisis funcional, así como de genomas fúngicos secuenciados y el análisis de transcriptomas han llevado a la caracterización de genes conocidos como genes de virulencia o patogenicidad en muchas especies de hongos.  

Fuentes

Oszust , K.;  Szpilska, K.;  Gryta, A.;  Panek, J.;  Pylak, M.;  Lipa, T.;  Frąc, M.  (2023). New biotechnological solutions in biocontrol and molecular diagnostics of Neofabraea spp. in apples – A review. Postharvest Biology and Technology, 204: 112442. http://www.agronomiaudec.cl/con-levaduras-buscan-controlar-el-ojo-de-buey-en-manzanas-del-tipo-criss-pink/ Acceso el 10/08/2023. https://mundoagro.cl/nuevo-sistema-puede-predecir-nivel-de-incidencia-de-ojo-de-buey-en-manzanas/ Acceso el 10/08/2023 Imagen https://prod.senasica.gob.mx/ALERTAS/inicio/pages/single.php?noticia=18373 Acceso el 10/08/2023.