Desarrollo de una prueba rápida de viabilidad para Cyclospora en frutas y hortalizas

Cyclospora cayetanensis, un protozoo parásito altamente complejo, es prácticamente imposible de cultivar en laboratorio y su detección requiere técnicas avanzadas de microscopía para confirmar su presencia en muestras. Aunque la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) cuenta con una técnica de detección molecular descrita en el Capítulo 19b del BAM, basada en PCR en tiempo real, esta metodología no permite distinguir entre parásitos vivos y muertos.

Un enfoque multifacético con Eimeria

El proyecto incorpora a Eimeria, un género de protozoos ampliamente reconocido como sustituto de Cyclospora debido a su disponibilidad, facilidad de cultivo y su estrecha relación genética con C. cayetanensis, evidenciada por una alta similitud en sus secuencias. Aunque Eimeria causa coccidiosis en pollos, su manejo es seguro para los humanos.

Como protozoos, Eimeria produce ooquistes, estructuras infecciosas de doble pared que pueden persistir durante meses en el medio ambiente. Sin embargo, los métodos actuales dificultan diferenciar entre ooquistes viables y no viables.

Inicialmente, Khan y su equipo probaron el uso de ciertos tintes que son repelidos por patógenos vivos y absorbidos por los muertos como forma de evaluar la viabilidad. Sin embargo, descubrieron que las paredes dobles de los ooquistes impedían la penetración de los tintes.

En paralelo, Jenkins proporcionó una colección de ooquistes de Eimeria en diferentes etapas de envejecimiento biológico. Mediante técnicas avanzadas de microscopía de alta resolución, el equipo de Khan identificó estructuras granulares características en los ooquistes no viables, las cuales estaban ausentes en los viables.

Además, descubrieron que al exponer los ooquistes no viables a luz ultravioleta, estas estructuras granulares fluorescían o brillaban. Utilizando el método de clasificación de células activada por fluorescencia (Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS), lograron separar los ooquistes vivos de los muertos basándose en diferencias de autofluorescencia.

Para validar estos hallazgos, los investigadores realizaron un ensayo in vivo en pollos, empleando 1,000 ooquistes clasificados con FACS. Los resultados demostraron que los ooquistes identificados como muertos presentaban una infectividad significativamente menor en comparación con los viables.

Avances tecnológicos y colaboración con IA

Más adelante, Khan se puso en contacto con Nitin Nitin, Ph.D., de la Universidad de California, Davis, a quien conoció durante un simposio de investigación organizado por el CPS. Según Khan:

“El laboratorio de Nitin cuenta con la experiencia necesaria para desarrollar herramientas capaces de distinguir distintas plagas bacterianas mediante modelos de inteligencia artificial (IA)”.

Para crear un modelo específico para Eimeria, el equipo de Khan recopiló miles de imágenes de tres especies diferentes del protozoo, clasificadas como vivas o muertas utilizando el método FACS.

Un sistema informático de alto rendimiento, equipado con algoritmos de IA, procesó estas imágenes y clasificó los ooquistes vivos y muertos al compararlos con una biblioteca de referencia previamente construida. Este enfoque alcanzó una precisión superior al 98%, evaluando tanto la sensibilidad (exactitud en la identificación de casos positivos) como la especificidad (reducción de falsos positivos).

Paralelamente, los investigadores examinaron el ARN de los ooquistes en diferentes etapas de envejecimiento y lograron identificar varios genes con patrones de expresión diferencial. Aplicando métodos más recientes y sensibles de PCR para análisis genético, descubrieron biomarcadores potenciales que podrían ser utilizados para distinguir entre parásitos vivos y muertos. Actualmente, se encuentran realizando ensayos adicionales para validar estos biomarcadores y confirmar su eficacia.

Aplicaciones futuras

Khan señaló que el proyecto financiado por el CPS, titulado “Un ensayo de viabilidad para Cyclospora y sus sustitutos Eimeria”, no solo tiene el potencial de transformar el manejo de la seguridad alimentaria en productos frescos, sino que también podría aportar mejoras significativas a los esfuerzos de control de la coccidiosis en la industria avícola.

Khan afirmó:

“Estoy convencido de que, en última instancia, esta investigación no solo beneficiará a quienes trabajan con productos hortofrutícolas, sino que también contribuirá al desarrollo de prácticas más sostenibles y eficaces en la gestión de la avicultura”.

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